Detecção rápida de SARS

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering volume 6, páginas 944–956 (2022)Cite este artigo

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O teste rápido de ácido nucleico é fundamental para a vigilância de doenças infecciosas. Aqui, relatamos um ensaio para teste rápido de COVID-19 e sua implementação em um protótipo de dispositivo microfluídico. O ensaio, que chamamos de DISCOVER (para diagnósticos com relatórios enzimáticos de coronavírus), envolve lise de amostras sem extração por meio de reagentes estáveis ​​e de baixo custo, amplificação de RNA isotérmica multiplexada seguida de transcrição de T7 e clivagem mediada por Cas13 de um fluoróforo extinto . O dispositivo consiste em um cartucho microfluídico acionado por gravidade de uso único inserido em um instrumento compacto para execução automatizada do ensaio e leitura da fluorescência em 60 minutos. O DISCOVER pode detectar o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2) na saliva com uma sensibilidade de 40 cópias μl–1 e foi 94% sensível e 100% específico quando validado (contra PCR quantitativo) usando RNA total extraído de 63 amostras de swab nasal (33 SARS-CoV-2-positivo, com valores de limiar de ciclo de 13–35). O dispositivo identificou corretamente todas as amostras clínicas de saliva testadas (10 SARS-CoV-2 positivo em 13, com valores de limiar de ciclo de 23–31). O teste rápido de ácido nucleico no local de atendimento pode ampliar o uso de diagnósticos moleculares.

A detecção rápida de ácidos nucleicos no local de atendimento é um componente crítico de uma infraestrutura de teste robusta para controlar a transmissão de doenças. Surtos como a pandemia da doença de coronavírus 2019 (COVID-19) destacaram as limitações do modelo de laboratório de diagnóstico centralizado e seu longo tempo de amostra para resposta. Testes desenvolvidos em laboratório, como a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), são realizados em instalações que exigem mão-de-obra intensiva e infraestrutura de equipamentos para coleta de amostras, extração de ácido nucleico, termociclagem e análise de dados. O transporte de amostras e o tempo de relatório de resultados também contribuem muito para os tempos de resposta de testes centralizados. O desenvolvimento de um dispositivo microfluídico fácil de usar emparelhado com detecção no local permitiria maior volume e acesso a testes moleculares rápidos.

Até agora, mais de 6 milhões de mortes por COVID-19 resultaram de mais de 500 milhões de infecções por seu agente causador, o coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2). Os inúmeros desafios de uma alta taxa de infecção assintomática1, testes insuficientes e a estreita janela de tempo para que os testes moleculares sejam altamente sensíveis2,3 podem ser combatidos pela ampla implantação de diagnósticos moleculares no local, como na entrada no local de trabalho ou na sala de aula. Há também um tremendo potencial para testes de vigilância comunitária para aumentar os fluxos de trabalho clínicos, onde os casos positivos são confirmados por encaminhamento para um suprimento mais restrito de testes de nível clínico. Métodos alternativos de amostragem e tecnologias de teste também podem ajudar a diversificar a cadeia de suprimentos de diagnóstico, pois o pipeline padrão para testes clínicos pode ser limitado pela escassez de kit de extração de RNA ou swab4,5.

Portanto, procuramos desenvolver um método que não exigisse extração de RNA ou zaragatoas do trato respiratório superior e pudesse ser integrado a um fluxo de trabalho microfluídico rápido e automatizado. Os ensaios baseados em qPCR foram desenvolvidos anteriormente com adição direta de amostras e normalmente usam uma alta temperatura para a lise da amostra6. Outras abordagens exploraram agentes caotrópicos, redução química e inibidores de RNase6,7,8,9. Além disso, as amostras de saliva têm 97% de concordância com swabs nasofaríngeos (NP)10,11.

A detecção baseada em repetições palindrômicas curtas regularmente interespaçadas agrupadas (CRISPR) é uma nova abordagem promissora para o diagnóstico de ácido nucleico. Esses métodos dependem da ativação dependente de RNA guia das nucleases Cas13 ou Cas12 para induzir atividade não específica de RNA de fita simples ou nuclease de DNA de fita simples, respectivamente, a fim de clivar e liberar uma molécula repórter enjaulada12,13,14, 15,16,17,18,19. O repórter liberado pode ser medido quantitativamente com um detector de fluorescência para ler o resultado do teste. A detecção baseada em CRISPR é altamente específica, mas as nucleases Cas13 sozinhas podem levar até 2 h para atingir a sensibilidade attomolar para aplicações de diagnóstico20,21. Em contraste, a amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) realiza uma amplificação de ácido nucleico altamente sensível em menos de 20 minutos com limites attomolares de detecção20 (LODs). No entanto, apesar da sensibilidade e velocidade do LAMP, tais métodos isotérmicos são frequentemente propensos a amplificação inespecífica22,23.