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May 12, 2023

Biologia da Comunicação volume 6, Número do artigo: 173 (2023) Cite este artigo

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Os organoides do cérebro humano totalmente amadurecidos e desenvolvidos por bioengenharia se destacam como modelos miméticos cerebrais tridimensionais in vitro altamente valiosos para recapitular o desenvolvimento cerebral in vivo, doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas. Vários sinais instrutivos que afetam vários processos biológicos, incluindo morfogênese, estágios de desenvolvimento, transições do destino celular, migração celular, função das células-tronco e respostas imunes, foram empregados para a geração de organoides cerebrais fisiologicamente funcionais. No entanto, as abordagens atuais para maturação requerem melhorias para organoides cerebrais altamente colhíveis e funcionais com variabilidades lote a lote reduzidas. Aqui, demonstramos duas abordagens de engenharia diferentes, o biorreator de microgravidade do sistema de cultura de células rotativas (RCCS) e uma plataforma microfluídica recém-projetada (µ-plataforma) para melhorar a colheita, a reprodutibilidade e a sobrevivência de organoides cerebrais de alta qualidade e comparar com os de organoides cerebrais tradicionais sistemas giratórios e agitadores. RCCS e organoides de plataforma µ atingiram tamanhos ideais, aproximadamente 95% de capacidade de colheita, tempo de cultura prolongado com células proliferativas Ki-67 + /CD31 + /β-catenina+, adesivas e semelhantes ao endotélio e exibiram diversidade celular enriquecida (abundante neural/glial/ população de células endoteliais), morfogênese estrutural do cérebro, outras identidades neuronais funcionais (secretores de glutamato glutamatérgicos, GABAérgicos e neurônios do hipocampo) e sinaptogênese (interação pré-sináptica-pós-sináptica) durante todo o desenvolvimento do cérebro humano. Ambos os organoides expressaram microglia CD11b + /IBA1 + e oligodendrócitos MBP + /OLIG2 + em níveis elevados a partir do dia 60. RCCS e organoides de plataforma µ mostrando altos níveis de fidelidade fisiológica um alto nível de fidelidade fisiológica podem servir como modelos pré-clínicos funcionais para testar novos esquemas terapêuticos para doenças neurológicas e benefícios da multiplexação.

A compreensão da geração, maturação e desenvolvimento funcional do cérebro é vital para compreender o desenvolvimento evolucionário do cérebro, bem como desenvolver estratégias de tratamento para doenças neurodegenerativas e do neurodesenvolvimento1,2. Embora os modelos animais sejam úteis para o exame mecânico, a recapitulação do desenvolvimento do cérebro humano é significativamente limitada devido a diferenças nos níveis celular e molecular3. Além disso, muito do nosso conhecimento atual do cérebro humano é baseado na análise de espécimes post-mortem ou patológicos inadequados para manipulação experimental4. Ultimamente, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), com a capacidade de se regenerar continuamente com fatores de reprogramação (OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4) e se diferenciar em todos os tipos de células do corpo, abriram um novo caminho para o estudo neural humano desenvolvimento5. Com o primeiro protocolo de geração de organoides cerebrais 3D derivados de iPSC publicado por Lancaster et al. organização do cérebro embrionário e assemelham-se à estrutura espacial do cérebro7. Além disso, semelhante ao processo de formação e desenvolvimento do cérebro no período embrionário, os organoides cerebrais podem imitar de perto o cérebro humano, gerando programas epigenômicos e transcricionais, como sinais associados à diversidade celular, esclarecimento de sinapses funcionais, formação de espinhas dendríticas e estabelecimento de redes neuronais autoativadas8,9.

Abordagens convencionais de maturação de organoides cerebrais, usando spinners10 e shakers11, promovem a autoorganização neuronal e a formação de espaços ventriculares cerebrais por meio de agitação. No entanto, esses métodos têm grandes limitações, incluindo difusão alterada de nutrientes e zonas apoptóticas devido à falta de vascularização, deficiência de células imunes, dependência de matrigel, baixa reprodutibilidade, escalabilidade e alta variabilidade dos componentes cerebrais induzidos e células12. Diferentes estratégias foram desenvolvidas para evitar essas limitações, como co-cultura com células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVECs)13 e células endoteliais derivadas de iPSC humanas não apenas para aumentar a difusão de oxigênio/nutrientes, mas também para alavancar a diferenciação neural, migração e formação de circuitos durante o desenvolvimento14. Outras estratégias concentram-se na recapitulação do ambiente microfisiológico celular com matriz extracelular cerebral descelularizada (MEC)15 ou matriz sintética tipo ECM para promover a diferenciação neural e glial durante a organogênese cerebral16,17. Embora não totalmente resolvidos, problemas de baixa reprodutibilidade, escalabilidade e alta variabilidade de organoides cerebrais foram superados com diferentes plataformas de organoides em chip18,19 ou novos sistemas de biorreatores, como biorreatores de roda vertical de uso único20. Apesar da progressão das tecnologias de organoides, as forças hemodinâmicas, como o estresse de cisalhamento, o alongamento cíclico e a distribuição de fluidos que regulam as vias mecanossensíveis nos organoides cerebrais ainda não são claramente compreendidas, o que é outra limitação crítica. No entanto, sabe-se que os sinais mecanossensíveis associados ao fluxo do líquido cefalorraquidiano durante a embriogênese regulam importantes adaptações estruturais, como a orientação da forma embrionária com efeito de assimetria esquerda-direita, a polarização das células gliais radiais, a diferenciação/funcionalização das células-tronco neurais e eventos posteriores de dobramento tecidual21,22. Assim, há a necessidade de desenvolver plataformas com o uso de princípios de biologia e engenharia que possam emular a dinâmica espaço-temporal e as interações célula-célula/célula-ambiente. Aqui, analisamos os efeitos de várias características de fluxo tanto computacional quanto experimentalmente na maturação de organoides cerebrais e eliciamos a melhor estratégia para a engenharia de organoides cerebrais 3D derivados de iPSC em níveis moleculares, celulares e funcionais. A plataforma microfluídica (µ-platform) permite o fluxo laminar acionado por gravidade que imita o fluxo de fluido existente nos espaços cerebrospinal e intersticial e melhora a comunicação entre células, o suprimento de oxigênio e a troca de nutrientes/resíduos7,23, levando a organoides mais duradouros. Além disso, as condições de microgravidade e fluxo laminar incomuns fornecidas pelos biorreatores do sistema de cultura celular de rotação horizontal (RCCS) exibem forças hidrodinâmicas homogêneas que facilitam o controle preciso a longo prazo das interações célula-célula e permitem alta colheita e reprodutibilidade de organoides cerebrais amadurecidos. O RCCS, inspirado por condições extraordinárias em tecnologias espaciais24, pode ser uma ferramenta única na pesquisa de organoides devido à redução da tensão de cisalhamento, aumento da transferência de massa e diminuição do dano celular em comparação com os sistemas tradicionais25. Nossa hipótese é que a microgravidade e os fluxos laminares impulsionados pela gravidade aumentam a maturação dos organoides cerebrais, levando a redes espaciais hierarquicamente complexas, recapitulando características do desenvolvimento cortical embrionário humano.